Трансгеноз и моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
Для разработки эффективных методов лечения заболеваний человека и понимания их этиологии требуется моделирование соответствующих симптомов на лабораторных животных. Для этого необходимо направленное введение мутаций в гены животных, инактивация которых приводит к развитию патологических процессов.
М. Хуперу и М. Куэну с соавторами (1987 г.) удалось разработать общий подход к избирательной инактивации генов в организме животных.
Мишенью для инактивации стал ген гипоксантин-гуанозин-фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ) , нефункциональное состояние которого у человека приводит к развитию заболевания Леша-Нихана . Мышей, дефектных по гену ГГФРТ, получали из эмбриональных стволовых клеток линии ES , инактивируя ген с помощью спонтанных мутаций или интегрируя в него геном ретровирусов (разновидность инсерционного мутагенеза ). Клетки с инактивированным геном ГГФРТ удобно отделять от клеток дикого типа на селективной питательной среде в присутствии 6-тиогуанина. Было показано, что инактивация гена ГГФРТ может быть достигнута путем гомологичной рекомбинации гена дикого типа с мутантным геном или его частью, которые вводят в клетки ES с помощью электропорации или микроинъекций в составе линеаризованных векторных плазмид .
Основная проблема, возникающая при инактивации гена-мишени с помощью гомологичной рекомбинации, заключается в низкой частоте (около 10-6) рекомбинационных событий, приводящих к правильной интеграции экзогенной последовательности нуклеотидов в инактивируемый ген. Эта проблема решается путем отбора требуемых мутантных клеток из общей популяции клеток, в которых интеграция инактивирующего вектора в хромосомы произошла случайным образом.
Чтобы создать селективные условия отбора, в последовательности нуклеотидов рекомбинантной ДНК, гомологичные последовательностям инактивируемого гена, вводят доминантный селектируемый маркер в виде гена устойчивости к антибиотикам (neo) , который экспрессируется только в случае правильной интеграции в ген-мишень под контроль его регуляторных элементов. Другая система отбора основана на одновременном проведении негативной и позитивной селекции клеток, у которых произошла правильная интеграция инактивирующего вектора. В этой системе помимо доминантного селектируемого маркера neo инактивирующий вектор содержит другой маркерный ген, экспрессия которого приводит к гибели клеток ES на селективной среде.
Маркерным геном часто является ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk) . Ген HSV-tk вводится в инактивирующий вектор таким образом, что он удаляется в результате гомологичной рекомбинации и сохраняется в хромосоме в случае неспецифической интеграции рекомбинантной ДНК, что приводит к цитотоксическому эффекту.
Обобщенная схема направленного введения мутаций в гены животных in vivo, которые приводят к их инактивации во всех клетках трансгенного организма (" генный нокаут "), представлена на рис. II.29 .
Разработка универсальных методов направленной инактивации любого требуемого гена во всех клетках организма трансгенных животных позволила за короткое время создать модели таких наследственных заболеваний человека, как бета-талассемия , мышечная дистрофия Дюшенна , серповидно-клеточная анемия , муковисцидоз , болезнь Леша-Нихана и других.
Инактивация генов-мишеней у лабораторных животных - не единственный способ моделирования наследственных и особенно приобретенных заболеваний человека, поскольку причиной многих заболеваний является не отсутствие функционирования, а сверхэкспрессия определенных генов. Например, высокий уровень экспрессии трансгена аполипопротеина AII сопровождается развитием острого атеросклероза у трансгенных мышей. Только исчерпывающее знание этиологии заболевания допускает его адекватное моделирование, и, наоборот, лишь создание адекватных моделей может убедить исследователя в том, что он правильно понимает его природу.
Смотрите также:
