мутация, изменяющие длину амплифицированных фрагментов: обнаружение
Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, протяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть выявлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцепленных с полом, основана на одновременной амплификации различных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные перестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР . Разница в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе. Особенно широко этот метод используется для идентификации делений в гене дистрофина , на долю которых приходится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дюшенна .
При отсутствии делеций все амплифицированные фрагменты после электрофоретического разделения и окрашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофореграмме. Выбирая специфические участки гена для амплификации, можно оценить размер делеции с точностью до отдельных экзонов, а также определить ее внутригенную локализацию.
Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции, находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последовательность геномной ДНК может служить матрицей для амплификации любых фрагментов. Данный подход применим к анализу делеций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплификации, провести так называемую количественную ПЦР .
Смотрите также:
