РНК-полимераза I эукариот: общие сведения
В отличие от большинства генов, кодирующих белки, гены, которые кодируют РНК, имеющие самостоятельное функциональное значение, транскрибируются РНК-полимеразой I и РНК-полимеразой III . Обычно эти гены представлены в геноме большим числом копий, часто образующих кластеры тандемных повторов.
РНК-полимеразой I образуются первичные транскрипты генов рРНК , известные как 45S-РНК, они имеют в длину около 13000 нуклеотидов. Прежде чем покинуть ядро в составе собранной рибосомной частицы , молекула 45S-РНК подвергается специфическому расщеплению , в результате чего образуется по одной копии 28S-РНК (около 5000 нуклеотидов), 18S-РНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,8S-РНК (около 160 нуклеотидов), которые собственно и являются компонентами рибосом. Общее происхождение всех трех типов рРНК из одного и того же первичного транскрипта служит гарантией того, что они образуются в равных количествах. Остальная часть этого транскрипта (около 6000 нуклеотидов) деградирует в ядре. Не исключено, что эти излишние последовательности молекулы-предшественника рРНК играют определенную роль на ранних этапах сборки рибосом, происходящих непосредственно по завершении синтеза 45S-РНК. Синтез гигантского предшественника рибосомных РНК осуществляется РНК-полимеразой I в специализированной внутриядерной органелле, называемой ядрышком, в котором находятся гены рибосомных РНК (рДНК). рДНК представляет собой специализированные участки (т.нзв. ядрышковые организаторы) нескольких хромосом.
Как и большинство других высокомолекулярных полипептидов, большие субъединицы РНК-полимераз содержат хорошо различимые структурные и функциональные домены. Клонирование генов соответствующих субъединиц и определение их первичной структуры позволили выявить эволюционно консервативные участки полипептидных цепей и провести мутационный анализ функциональной значимости их отдельных доменов. Для этой цели в полипептидных цепях с помощью направленного мутагенеза заменяли соответствующие аминокислоты и мутантные субъединицы использовали в сборке ферментов из отдельных субъединиц in vitro с последующим анализом свойств таких реконструированных ферментов. На рис. I.4,а суммированы данные, полученные для двух самых больших субъединиц (RPA194 и RPA116) Pol I мышей , которые являются функциональными аналогами бета'- и бета-субъединиц РНК-полимеразы E.coli .
РНК-полимераза I не реагирует на присутствие альфа-аманитина - высокотоксичного вещества, получаемого из бледной поганки в отличие от РНК-полимеразы II , которая очень чувствительна к нему. Клетки высших эукариот содержат около 40000 молекул РНК- полимеразы I. См. также разделы: Регуляция транскрипции РНК-полимеразой I и Промотор РНК-полимеразы I .
РНК-полимераза I эукариот является большим ферментом, построенным по меньшей мере из 11 субъединиц.( Sentenac, 1985 , Lalo и сотр., 1993 , Woychik и сотр., 1990 ). Минимальный фермент Pol I содержит два больших полипептида с молекулярной массой 194 и 116 кДа, которые ассоциированы с несколькими малыми субъединицами (от 3 до 14 в зависимости от метода очистки), молекулярные массы которых лежат в пределах 15- 60 кДа. Третья по величине субъединица Pol I мышей с молекулярной массой 53 кДа, названная PAF53 (polymerase associated factor 53) , играет важную роль в узнавании Pol I своих промоторов и, по- видимому, является структурным и функциональным аналогом белка RPA49 дрожжей . Pol I дрожжей в отсутствие субъединиц RPA49 и RPA35.5 (так называемая Pol I*) эффективно транскрибирует при низких концентрациях солей искусственную матрицу poly[d(A-T)], но не нативную двухцепочечную ДНК. Полагают, что эти субъединицы необходимы для эффективного образования инициационных комплексов.
Используя антитела к отдельным субъединицам Pol I и последующую иммунопреципитацию, установили, что в клетке часть Pol I находится в составе больших комплексов, с которыми ассоциированы факторы транскрипции. Пять компонентов холофермента Pol I изучены в настоящее время наиболее детально.
Было показано, что РНК-полимераза I (аналогично РНК-полимеразе II ) может существовать в двух формах: одна форма способна инициировать специфическую транскрипцию in vitro, а другая форма, хотя и имеет ДНК-зависимую РНК- полимеразную активность in vitro, не способна к специфической инициации ( Bateman и Paule, 1986 , Tower и Sollner-Webb, 1987 , Buttgereit и сотр., 1985 , Mahajan и Thompson, 1990 ). Есть данные указывающие на то, что активная и неактивная формы РНК- полимеразы I отличаются степенью фосфорилирования и, возможно, определенными посттрансляционными модификациями ( Bateman и Paule, 1986 , Tower и Sollner-Webb, 1987 ).
Для транскрипции рДНК in vitro, помимо самой РНК- полимеразы I, необходимы два фактора транскрипции - UBF и SL1 . Фактор UBF способен связываться с промотором непосредственно, в то время как для связывания SL1 необходимо присутствие UBF ( Smith и сотр., 1990 , Bell и сотр., 1988 , Iida и Paule, 1992 , McStay и сотр., 1991 , Schnapp и Grummt, 1991 ). В экспериментах по транскрипции рДНК in vitro было обнаружено, что некоторый минимальный уровень транскрипции поддерживается и при отсутствии UBF ( Smith и сотр., 1990 , Iida и Paule, 1992 , Smith и сотр., 1993 ).
Одно из возможных объяснений данного эффекта предполагает роль UBF как стимулятора транскрипции рДНК в периоды роста и развития, в то время как в фазе покоя поддерживается минимальный уровень транскрипции, не требующий участия транскрипционных факторов. С другой стороны, при транскрипции in vitro используются значительно более высокие концентрации рДНК матрицы по сравнению с внутриклеточными концентрациями, что может приводить к некоторому минимальному уровню транскрипции в отсутствии UBF.
Смотрите также:
