Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)
Иммуноферментный анализ, ИФА, ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay), ферментный иммуносорбентный анализ (лат. fermentum — закваска; лат. immunis — свободный, избавленный от чего-либо и sorbeo — поглощать; греч. analysis — разложение, расчленение) - высокочувствительный метод иммунохимического анализа на основе ферментсвязанного иммуносорбента, используемый для определения специфических антигенов в сложной смеси. В наиболее распространенном варианте этого теста применяют два препарата антител: первичные антитела, специфические для тестируемого белка, адсорбируют на твердую подложку, к которой добавляют определенное количество анализируемого образца; затем для выявления комплекса «антитело-антиген» добавляют вторичные антитела, специфичные для другого участка тестируемого белка, которые конъюгированы с ферментом. Фермент катализирует изменение окраски специального субстрата, добавляемого в последнюю очередь, что регистрируется фотометрически. Этот тест широко используется для диагностики различных заболеваний.
ИФА (ELISA) в различных модификациях этого метода используется для выявления вирус-специфических антигенов в крови, ликворе, органах и тканях больных людей и животных, а также в экспериментальных материалах (инфицированные клеточные культуры, органы лабораторных животных и т.п.). С помощью ИФА возможна идентификация выделенных вирусов. Методы ИФА широко используются для серологической диагностики вирусных инфекций, изучения иммуноструктуры населения, определения статуса гуморального иммунитета у вакцинированных и других целей7
Метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экономичностью, быстротой выполнения. При необходимости реакция может быть поставлена в полевых условиях.
Для постановки ИФА необходимы следующие ингредиенты: специфические вирусные антигены, нормальные антигены, иммуноглобулины к М- и G-белкам человека, специфические и нормальные иммуноглобулины, положительные IgM или IgG позитивные сыворотки больных, нормальные сыворотки людей, пероксидазные конъюгаты глобулинов, карбонатно-бикарбонатный, фосфатный, цитратно-фосфатный буферы, раствор для отмывания лунок планшетов, хромоген (раствор тетраметилбензидина), раствор бычьего альбумина, перекись водорода, серная кислота. Реакцию ИФА выполняют в 96-луночных полистироловых планшетах, учитывая оптическую плотность в опытных и контрольных лунках на спектрофотометре с длиной волны 450 нм.
ИФА для определения специфических вирусных антигенов ("сэндвич"- ИФА). Принцип выявления антигенов вирусов в ИФА заключается в том, что специфические иммуноглобулины, прикрепленные к поверхности лунок полистироловых планшетов, сорбируют антиген из исследуемого образца и образуют иммунный комплекс со специфическим конъюгатом, что выявляется затем при добавлении субстрат-индикаторного раствора.
Этот метод позволяет выявить специфические антигены при содержании в обследуемых материалах инфекционного вируса не менее 1,0-2,5 Ig (ЛД50), или ТЦД50, или 10-150 БОЕ.
ИФА для выявления ("захвата") специфических иммуноглобулинов класса М (ИФА-IgM, MAC-ELISA). Принцип определения специфических антител класса М в сыворотках людей и животных заключается в "улавливании" этих антител иммуноглобулинами против IgM человеческой сыворотки, сорбированными на поверхности лунок, и образовании иммунного комплекса специфических антител, специфического антигена и конъюгата с последующим проявлением его в субстратно-индикаторном растворе.
На первом этапе постановки реакции лунки планшетов сенсибилизируют антителами (обычно козьими) против мю-цепи IgM человека. Данная модификация ИФА позволяет избежать ложноположительных результатов, связанных с наличием ревматоидного фактора . ИФА-IgM является методом серологической экспресс-диагностики, т.к. при многих острых вирусных инфекциях специфические IgM-антитела в сыворотке крови и ликворе появляются уже в первые дни заболевания, но исчезают, чаще всего, через 3-5 мес после выздоровления. Их титры достигают иногда (например, при лихорадке Западного Нила и клещевом энцефалите ) очень высоких значений - 1:102400-204800.
Обнаружение специфических IgM в однократно взятых сыворотках, а также выявление их сероконверсии в парных сыворотках указывают, как правило, на наличие острой первичной инфекции.
ИФА для определения специфических IgG - непрямой "сэндвич"-ИФА (ИФА-IgG). Данная модификация предназначена для обнаружения специфических IgG в сыворотках крови больных людей, реконвалесцентов, для изучения иммуноструктуры населения, определения показателей иммунитета у вакцинированных лиц и других целей.
Последовательность внесения специфических компонентов ИФА-IgG: иммуноглобулин->вирусные антигены->пероксидазный конъюгат гетерологичных антител (глобулинов) против IgG человека.
При проведении серологической диагностики в ИФА-IgG надо исследовать парные сыворотки больных с целью выявить сероконверсии антител.
ИФА для определения авидности IgG. Метод определения авидности IgG антител основан на том, что в процессе формирования IgG-антител, развитии гуморального иммунитета при заболевании и выздоровлении пропорция специфических высокоавидных антител возрастает. Поэтому присутствие низкоавидных IgG-антител указывает на первичный характер инфекции, тогда как высокоавидные IgG типичны для предшествующего заболевания, реактивации инфекции или повторной инфекции. Степень авидности IgG выявляется при сравнительном определении их активности методом ИФА-IgG в сыворотках, обработанных и необработанных мочевиной, и выражается как индекс авидности . Он представляет собой соотношение сигнала обработанной мочевиной сыворотки к сигналу необработанной. Авидность менее 30% считается низкой и рассматривается как признак острой первичной инфекции, имевшей место в течение последнего месяца после начала заболевания. Высокая авидность ( более 50%) указывает на анамнестический характер антител.
Современные подходы к совершенствованию иммуноферментных тест-систем заключаются в использовании рекомбинантных вирусных белков, концентрированных и очищенных антигенов (в качестве подложки) и антигенов, меченных пероксидазой хрена, а также в применении моноклональных антител и новых твердофазных носителей, позволяющих сократить время постановки реакции до 15-20 мин.
Твердофазный иммуноферментный анализ - надежный, экономичный и высокочувствительный метод. Он основан на использовании стандартных препаратов, очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента.
Иммунологический анализ с помощью меченых реагентов
Смотрите также:
