Непрямой метод флюоресцирующих антител
Непрямой метод флюоресцирующих антител включает два этапа постановки: сначала неконъюгированная иммунная сыворотка реагирует с антигеном, а затем с образовавшимся комплексом вступает во взаимодействие конъюгированный антивидовой белок, специфичный в отношении вида-источника иммунной сыворотки.
Основные детали проведения реакции непрямой иммунофлюоресценции сводятся к следующему. На фиксированные препараты наносят по 1 капле нативной иммунной сыворотки, распределяя ее по всей поверхности препаратов, инкубируют их во влажной камере 30 мин при температуре 37*С, тщательно отмывают проточной водой 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают при комнатной температуре и наносят меченные флюорохромом антивидовые антитела (в рабочем разведении). После контакта во влажной камере при температуре 37*С в течение 30 мин препараты тщательно отмывают, как и в первом случае, подсушивают на воздухе и просматривают в люминесцентном микроскопе. В отличие от прямого метода с помощью непрямой иммунофлюоресценции можно не только выявлять и типировать вирусный антиген, но и проводить индикацию и титрование противовирусных антител.
Для этой цели готовят 2- или 10-кратные разведения исследуемой иммунной сыворотки на физиологическом растворе. Каждое разведение наносят на стекло с фиксированными антигенсодержащими клетками, выдерживают во влажной камере 30 мин при температуре 37*С, отмывают, подсушивают, наносят меченную флюорохромом антивидовую сыворотку и после контакта и отмывки просматривают в люминесцентном микроскопе. Титром сыворотки считают ее конечное разведение, вызывающее отчетливое специфическое свечение не менее чем в 15 клетках препарата. При использовании непрямого теста иммунофлюоресценции в целях серодиагностики целесообразно иметь запас заранее приготовленных и фиксированных в ацетоне антигенсодержащих клеточных культур. Процесс их приготовления заключается в следующем.
Во флаконы с вложенными в них кусочками покровных стекол вносят клеточную суспензию в концентрации от 100 до 150 тыс. клеток в 1 мл (в зависимости от вида клеточной линии). Для исследований с арбовирусами наиболее часто используют культуры клеток Vero, ВНК-21, фибробласты куриных эмбрионов, клетки комариных культур. Через 24-48 ч после посева клеток и образования монослоя культуру однократно промывают физиологическим раствором или питательной средой без сыворотки, во флакон вносят 0,2 мл вируссодержащего материала. При этом рабочее разведение вируса выбирается таким образом, чтобы число инфицированных клеток в готовом препарате составляло не менее 30%. Контакт вируса с клетками осуществляют при температуре 37*С в течение 30-40 мин, затем неадсорбированный вирус удаляют из флаконов и в них вносят по 1-2 мл поддерживающей среды без сыворотки. В тех случаях, когда клетки заражают вируссодержащей культуральной жидкостью, во флаконы ее сразу вносят по 1-2 мл в соответствующем разведении. Зараженные культуры переносят в термостат с температурой 37*С. Через определенное время препараты выборочно просматривают в люминесцентном микроскопе (по 2-3 стекла), при обнаружении в клетках достаточного количества специфического вирусного антигена остальные клетки тут же фиксируют.
Для просмотра препаратов, обычно заключенных в дистиллированную воду или в щелочные буферные растворы (например, глицерин с 10% раствором трис-буфера в соотношении 9:1), рекомендуется использовать водно-иммерсионный объектив, возбуждающие фильтры ФС-1-2, СС-15-2, ВС-8-2 и запирающие фильтры N1 или 2 (для отечественных микроскопов). Правильно выбранная смесь конъюгатов должна обеспечить изумрудно-зеленое свечение специфического антигена в инфицированных клетках на слабом оранжево-красном, желто-оранжевом или серо-желтом фоне флюоресценции нормальных клеток. Оценку интенсивности вызываемого свечения проводят по общепринятой 4-крестовой шкале:
++++ - очень интенсивная,
+++ - интенсивная,
++ - достаточно яркая,
+ - слабо выраженная
- (минус) - отсутствие свечения (клетки окрашены в оранжево- красный или серо-желтый цвет).
Реакция иммунофлюоресценции предусматривает постановку следующих обязательных контролей: 1) окрашивание специфическим конъюгатом неинфицированных контрольных клеток; 2) окрашивание инфицированных клеток гетерологичным конъюгатом или, при непрямом варианте иммунофлюоресценции, предварительная обработка инфицированных клеток гетерологичной сывороткой; 3) обработка инфицированных клеток неиммунными сыворотками.
Во всех этих вариантах контролей в препаратах должна наблюдаться слабая оранжево-желтая, серо-желтая или оранжево-красная флюоресценция фона.
Смотрите также:
