Прямые методы лабораторной диагностики вирусных инфекций
Прямые методы диагностики клинического материала - это методы, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту непосредственно в клиническом материале, т.е. являются наиболее быстрыми (2-24 ч). Однако из-за ряда особенностей возбудителей прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.
Электронная микроскопия (ЭМ) . С помощью этого подхода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна составлять примерно 1000000 частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя, как правило, в материале от больных незначительна, то поиск вируса затруднен и требует предварительного его осаждения с помощью высокоскоростного центрифугирования с последующим негативным контрастированием. Кроме того, ЭМ не позволяет проводить тонкое типирование вирусов, т.к. у многих из них нет морфологических различий внутри семейства. Например, ВПГ , ЦМВ или вирус опоясывающего герпеса морфологически практически неотличимы.
Одним из вариантов ЭМ, используемым в диагностических целях, является иммунная ЭМ, при которой применяются специфические антитела к вирусам. В результате взаимодействия антител с вирусами образуются комплексы, которые после негативного контрастирования легче обнаруживаются.
Иммунная ЭМ несколько более чувствительна, чем ЭМ, и используется в тех случаях, когда вирус не удается культивировать in vitro, например при поиске возбудителей вирусных гепатитов .
Метод флюоресцирующих антител (МФА) . Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. МФА широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики. В практике применяются два варианта МФА: прямой метод флюоресцирующих антител и непрямой метод флюоресцирующих антител . МФА широко применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Успешное применение МФА для прямого определения вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.
Иммуноферментньй анализ (ИФА) . Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов или антител в принципе сходны с МФА, но основываются на ме-чении антител ферментами, а не флюоресцентными красителями. Метод подробно описан в разделе 2.3.1.5. Поскольку с помощью ИФА можно измерять растворимые антигены, то не требуется наличия интактных клеток в образце и могут использоваться различные виды клинического материала.
Другое важное преимущество метода ИФА - возможность количественного определения антигенов, что позволяет применять его для оценки клинического течения болезни и эффективности химиотерапии. ИФА, как и МФА, может применяться как в прямом, так и в непрямом варианте.
Твердофазный ИФА, дающий растворимый окрашенный продукт реакции, нашел наибольшее распространение. ИФА может быть использован как для определения антигена (на твердую фазу - дно лунки полистиролового планшета - наносятся антитела), так и для определения антител (на твердую фазу наносятся антигены).
Радиоиммунный анализ (РИА) . Метод основан на метке антител радионуклидами, что обеспечивает высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 1980-х годах, особенно для определения маркеров вируса гепатита В и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использование дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).
Молекулярные методы. Первоначально классическим методом выявления вирусного генома считался высокоспецифичный метод гибридизации нуклеиновых кислот, но в настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью ПЦР , ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени . Этот метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий вирусной ДНК в исследуемом материале. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций (вирусы гепатитов, герпеса, папилломы, ЦМВ и др.). Разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определять число копий амплифицируемого сайта ДНК. Методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.
Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При ЦМВ-инфекции , например, в срезах ткани или в моче обнаруживаются характерные гигантские клетки - "совиный глаз", при бешенстве - включения в цитоплазме клеток ( тельца Бабеша-Негри ). В некоторых случаях, например при дифференциальной диагностике хронических гепатитов, имеет значение оценка состояния ткани печени.
Смотрите также:
