p53: История изучения
Менее чем за 20 лет взгляды ученых на роль белка р53 в клетке несколько раз менялись коренным образом. Короткая, но достаточно интригующая история изучения р53 могла бы стать хорошей иллюстрацией к процессу познания функционирования биологических систем.
Развитие представлений о функции белка р53 проходило через несколько этапов:
1979 год - р53 - опухолевый антиген,
1984 год - р53 - онкоген,
1989 год - р53 - опухолевый супрессор,
1992 год - р53 - "страж" генома,
1994 год - р53 - регулятор транскрипции ряда генов, в т.ч. генов контроля клеточного цикла и жизнеспособности клеток.
По меткому определению Weinberg, р53 является "нарушителем правил", поскольку по ряду особенностей своего поведения он отличается от других генов супрессоров ( Weinberg R.A., 1991 ).
Впервые ядерный ДНК-связывающий белок р53 был идентифицирован в 1979 году в составе комплекса с большим Т- антигеном SV40 ( Lane D.P., Crawford L.V., 1979 ). Обнаружение этого комплекса в клетках, трансформированных SV40 , стало первым примером прочного взаимодействия между клеточными и вирусными белками ( Linzer and Levine, 1979 , Lane and Gannon, 1983 ).
В дальнейшем было установлено, что р53 экспрессируется на высоком уровне практически во всех типах опухолей разной локализации и присутствует в небольших количествах в нормальных клетках ( Levine A.J., Momand J.M., ea, 1991 , Stanbridge E.J., 1990 ).
В 1982 году была проклонирована кДНК и определена первичная последовательность гена р53 мыши ( Чумаков и др. 1982 , Oren M., Levine, 1983 , Pennica et al., 1984 ). Некоторые различия в опубликованных последовательностях кДНК позднее обьяснились присутствием в гене р53 из трансформированных клеток точечных мутаций, которые приводят к его онкогенной активации ( Finlay et al., 1988 , Michalovitz et al., 1991 ). Последовательность гена р53 дикого типа была установлена при секвенировании клонов, полученных из нормальных тканей. Использование в качестве зонда кДНК р53 мыши позволило в 1984 году клонировать ген р53 человека и позже определить его первичную структуру ( Harlow et al., 1985 , Zakut-Houri et al., 1985 , Бухман и др., 1987 ).
Ген р53 человека имеет размеры 20 кб,и состоит из 11 экзонов.
Размер мРНК - 2,6 кб. Ген р53 эволюционно консервативен и гомологичен генам р53 других млекопитающих ( Albor A., Laborda J., ea, 1994 , Lamb P., Crawford L., 1986 , Levine A.J.,1993 , Miller C., Mohandas T., ea, 1986 , Zakut-Houri R., Oren M., ea, 1983 ).
Клонирование гена р53 позволило приступить к изучению его биологических свойств. В 1984 году было установлено, что кДНК гена р53 под сильным промотором/ энхансером способна иммортализовать первичные хондроциты крысы ( Jenkins et al., 1984 ). Кроме того, р53 оказался способным кооперировать аналогично онкогену myc или белку E1a аденовирусов с активированным онкогеном c-Ha-ras ( Parada et al., 1984 , Zambetti et al., 1992 ). При введении гена р53 в спонтанно иммортализованные перевиваемые культуры клеток последние приобретали большую независимость роста от сыворотки и становились туморогенными для лабораторных животных ( Eliyahu et al., 1984 ). На основании этих свойств было предположено, что ген р53 является доминантным ядерным онкогеном.
Последующие работы, однако поставили эту гипотезу под сомнение. Было обнаружено, что онкогенные свойства р53 могут быть усилены введением искуственных мутаций, что сопровождалось также повышением стабильности белка. Когда же было секвенировано много независимо выделенных генов р53, выяснилось, что почти все они имеют точечные мутации в кодирующей области ( Zakut-Houri et al., 1985 ). Все мутантные клоны р53 были получены из трансформированных или иммортализованных культур клеток. Поэтому многие эксперименты были повторены с геном дикого типа и было установлено, что р53 дикого типа не только не вызывал трансформацию, но наоборот угнетал онкогенное действие мутантных вариантов р53 ( Finlay et al., 1989 ). При введении гена р53 в трансформированные клетки происходил блок деления в фазе клеточного цикла G и через некоторое время клетки подвергались апоптозу . Нормальные клетки, в отличие от трансформированных, лучше переносили экспрессию р53 дикого типа. Мутанты р53, напротив, были совершенно нетоксичны для опухолевых клеток и иногда даже усиливали трансформацию. Таким образом, ген р53 стали рассматривать как антионкоген или ген-супрессор злокачественного роста ( Lane and Benchimol, 1990 ). Была проанализирована структура гена р53 и его повреждения при различных неоплазиях с целью установления конкретных механизмов инактивации этого гена в канцерогенезе .
Ген р53 был исследован в опухолях мозга, кишечника, молочной железы, в лейкозах и лимфомах, опухолях легкого, печени, яичника, в иммортализованных фибробластах мыши. Выявлены все типы мутвций, но для р53 наиболее характерны точечные мутации ( Cheng J., Haas M. 1990 , Harvey D., Levine A.J.,1991 , Hollstein M., Sidransky D., ea, 1991 , Kupryjanczyk J., Thor A.D., ea, 1993 , Nigro J.M., Baker S.J., ea, 1989 , Runnebaum I., Nakarajan M., ea, 1991 , Sheffner M., Munger K., ea, 1991 ).
Секвенирование гена р53 у человека и других млекопитающих показало, что в нем присутствуют 5 высоко консервативных доменов, четыре из которых представляют собой "горячие точки", в которых возникает большинство мутаций. Это экзоны 5-8 (кодоны 117-142, 171-181, 234-258 и 270-286) ( Hollstein M., Sidransky D., ea, 1991 , Ory K., Legros Y., ea, 1994 ).
В некоторых случаях отмечена особая специфичность локализации мутаций. Известен редкий синдром Ли-Фраумент (Li-Fraument),который наследуется как аутосомный доминантный признак и характеризуется высокой частотй возникновения различных типов опухолей.
Мутации возникающие в разных сайтах гена р53 отличаются разным трансформирующим потенциалом. Мутации в кодонах 143, 175 и 275 обладают сильным трансформирующим эффектом и соответственно слабой супрессирующей активностью. Чем выше трансформирующая активность мутанта, тем слабее выражена дифференцированность опухолевой ткани ( Kupryjanczyk J., Thor A.D., ea, 1993 ). В Табл.2 представлены результаты анализа различных типов мутаций в кодонах 175,248, и 273 на основе данных 270 публикаций. Эти мутанты составляют 21,6% от общего числа точечных мутаций, выявленных в различных опухолях человека.
Как и при анализе гена Rb убедительным доказательством супрессорной активности нормального аллеля гена р53 послужили результаты их трансфекции в злокачественные клетки. В частности был исследован температурочувствительный (ts)мутант р53, у которого валин заменен на аланин в положении 135. Этот мутант характеризуется свойствами нормального аллеля при пермиссивной температуре 32,5*50*0С и мутантного аллеля при рестриктивной температуре 37,5*50*0C. Как и следовало ожидать, ингибирование трансформации и пролиферации после трансфекции наблюдалось только при пермиссивной температуре ( Michalovitz D., Halevy O., ea, 1990 ).
Если для подавления супрессорной активности рRb всегда необходима гомозиготность по мутациям, что характерно для рецессивных мутаций, то р53, как " нарушитель правил", может ингибировать супрессию без потери гетерозиготности, т.е. действовать как доминант.
Такой доминантный негативный эффект позволяет мутантам р53 индуцировать трансформацию в присутствии нормального аллеля р53. Это объясняется способностью р53 образовывать в ходе трансляции комплексы (тетрамеры и олигомеры более высокого порядка), в которые могут входить как нормальные, так и мутантные белки.
Ответственным за олигомеризацию является С-конец белка р53. Многие мутанты р53 отличаются по своей конформации от нормального белка. В таких случаях при образовании комплексов нормальный белок приобретает "мутантную" конформацию ( Milner J., Medcalf E.A., 1994 , Weinberg R.A., 1991 ). Так, при котрансфекции нормального аллеля р53 человека с ts мутантом р53val135 мыши, при рестриктивной температуре 37*50*0С р53 человека приобретал мутантную конформацию, в то время как при пермиссивной температуре 30*50*0С оба белка имели конформацию нормального р53 ( Milner J., Medcalf E.A., 1994 ).
Комплексы нормальных и мутантных р53 бывают часто связаны с белком теплового шока Нsc70 , который, по-видимому, способствут олигомеризации и стабилизации комплекса. Нередко эти комплексы локализованы в цитоплазме и потому не могут осуществить свою супрессорную функцию ( Finlay C.A., Hinds P.W., ea, 1988 , Hinds P., Finlay C., ea, 1987 , Weinberg R.A., 1991 ).
Однако не все мутации изменяют конформацию нормального р53. Так, мутация р53 trpt 248, ассоциированная с синдромом Ли-Фраумент , не вызывает появления мутантной конформации при котрансфекции с нормальным р53 ( Milner J., Medcalf E.A., 1994 ). По-видимому, для осуществления доминантного негативного эффекта играет роль соотношение числа молекул мутантного и нормального р53. В некоторых случаях при соотношении 1:1 такой эффект отсутствует ( Chen P.L., Chen Y., ea, 1990 ). Несмотря на то, что явление доминантного негативного эффекта достаточно типично для мутантов р53, оно не является абсолютным, также как изменение конформации мутантных белков ( Ory K., Legros Y., ea, 1994 ).
Уровень р53 в нормальных клетках невысок. Известно также, что трансгенные мыши с двумя null аллелями р53 жизнеспособны ( Donehower L.A., Harvey M., ea, 1992 , Harlow E.1992 ), т.е. присутствие р53 казалось бы не является необходимым для нормального роста и развития. Вместе с тем, у таких мышей наблюдается высокая частота возникновения опухолей ( Donehower L.A., Harvey M., ea, 1992 ).
Очевидно наличие нормального аллеля р53 предотвращает неконтролируемый рост, Имеются данные об изменении количества р53 в различных фазах деления, которое достигает максимума при переходе из G1 в S фазу ( Hollingsworth R.E., Lee W-H., 1991 ), т.е. экспрессия р53 регулируется в ходе клеточного цикла ( Shaulski G., Ben-Ze ev A., ea, 1990 ).
К настоящему моменту стало очевидным, что р53 находится на перекрестке регуляторных и метаболических путей в клетке и играет существенную роль в ансамбле клеточных процессов.
Смотрите также:
