NF-kB Белок
NF-kappaB был вначале идентифицирован Sen и Baltimore [ Sen ea 1986 ], как конститутивный транскрипционный фактор, связывающийся со специфической последовательностью kB (см. Табл 1 svtr ) в энхансере гена каппа легкой цепи иммуноглобулина в B клетках. Цитоплазматический фактор транскрипции NF-кВ уникален тем, что может активироваться большим числом внутриклеточных путей, индуцируемых воспалительными цитокинами, окисленными липидами, факторами, присутствующими в атероматозных бляшках, и запускать быструю активацию множества генов [ Mackman, ea 1997 ]. NF-кВ существует в цитозоле многих клеток как неактивный комплекс, состоящий из Rel-родственных белков, включая р65 (Rel А) и р50 (NF-кВ1), связанных с ингибиторными белками, называемыми IкВ [ Khachigian, ea 1996 , Bourcier, ea 1997 ]. Члены семейства Rel содержат активационные домены, необходимые для индукции генов, и отличаются друг от друга по своим ДНК- связывающим свойствам, которые обеспечивают дополнительный уровень контроля генов [ Heissmeyer, ea 1999 ]. Обычно в цитоплазме существует неактивный гетеромерный комплекс NF-кВ, ассоциированный с одним из нескольких ингибиторов IкВ (IкВальфа, IкВбета или др.) [ Heissmeyer, ea 1999 ]. Он регулирует большое разнообразие генов, так и в том, что очень большое число стимулов приводит к его активации. NF-кВ оказывается важным интегрирующим устройством клетки. Комбинаторное использование его разных субъединиц приводит к возможности дифференциальной регуляции множества генов с различными функциями в разных типах клеток в разное время [ Perkins ea 1997 ]. Все эти белки работают в клетке, как ДНК связывающие транскрипционные факторы, активность которых регулируется в значительной степени на уровне локализации в клетке. МАР киназы могут регулировать транскрипцию, фосфорилируя ингибиторы факторов транскрипции. В случае NF-kB как раз и осуществляется подобная регуляция.
В типичном случае NF-kB находится в цитоплазме в виде комплекса с одним из членов семейства ингибиторных белков I-kB . Он и удерживается в цитоплазме этим ингибитором за счет белок-белковых взаимодействий. Роль ингибитора в том, что он маскирует сигнал ядерной локализации фактора. Это как раз пример пассивного репрессора. Ингибитор фосфорилирован, но при получении сигнала он фосфорилируется интенсивнее и затем деградирует. Мы точно не знаем, какие именно из киназ осуществляют фосфорилирование в ответ на внеклеточные сигналы. Положение осложняется тем, что есть несколько родственных ингибиторов, и, возможно, разные ингибиторы фосфорилируются разными киназами. Но, как бы там ни было, фактор NF-kB освобождается и направляется в ядро , где взаимодействует со специфическими последовательностями в регуляторных участках генов и активирует транскрипцию определенных групп генов. Все это схематически показано на Рис. 17 svtr.
Baeuerle и Baltimore (1988 ) показали, что NF-kB в цитоплазме неиндуцированных клеток существует в неактивном виде. Применяя денатурирующие или диссоциирующие агенты, исследователи превратили цитозольную неактивную форму NF-kB в активную, которая способна связываться с фрагментом ДНК, содержащим энхансер k-иммуноглобулинового гена . Неактивное состояние цитозольного NF-kB является результатом присоединения к нему белка (60-70кД), названного IkB. Обычно в цитоплазме существует неактивный гетеромерный комплекс NF-кВ, ассоциированный с одним из нескольких ингибиторов IкВ (IкВальфа, IкВбета или др.) [ Heissmeyer, ea 1999 ]. Активация NF-кВ происходит в результате фосфорилирования сериновых остатков ингибиторного белка IкВ регулируемыми убиквитином сериновыми киназами и последующей деградации фосфорилированного IкВ мультикаталитическим протеосомным комплексом [ Heissmeyer, ea 1999 , Chen, ea 1995 , Simeonidis, ea 1999 ]. Инактивация IкВ является центральным событием воспалительного процесса , которое ведет к экспрессии генов адгезивных молекул ( ICAM , VСАМ ) и цитокинов ( TNF-a , IL-1 и др.). Spl и Egr-1 - транскрипционные факторы, в структуре которых содержатся петли, называемые цинковыми пальцами, способные связываться с ДНК и регулировать транскрипцию множества генов [ Khachigian, ea 1998 ]. IkB покрывает сайт связывания NF-kB ( Baeuerle and Baltimore, 1988 ). Авторы предполагают, что этот самый IkB может служить субстратом протеинкиназы С и протеинкиназы А . В фосфорилированном виде он отсоединяется от NF-kB. Освобожденный NF-kB затем способен присоединяться к ДНК и транслоцироваться в ядро.
Множество генов, регулируемых NF-kB, содержат один или несколько NF-kB связывающих последовательностей. Видимо в регуляции разных генов, индуцируемых в ответ на разные стимулы участвуют разные комбинации субъединиц [ Perkins ea 1997, Perkins ea 1992]. Например, в ответ на действие фактора некроза опухоли ( TNF-alpha ) в ядре быстро появлялись димерные комплексы p50-p65, p50-c-Rel, p65-c-Rel, p52-c-Rel и p52-p65. Это связывают с необходимостью разных димеров для регуляции разных генов [ Perkins ea 1997, Perkins ea 1992, Beg ea 1994].
Другой пример. В процессе вызревания B-лимфоцитов в предшественниках B клеток обнаруживается гетеродимер, состоящий из p50-p65 субъединиц, тогда как в B клетках гетеродимер состоит главным образом из p50-p75/c-rel.
Происходит переключение регуляторного комплекса, и новый гетеродимер начинает, по-видимому, стимулировать новые гены. Все это показывает, какая сложная комбинаторика используется в тонкой регуляции экспрессии отдельных частей генома [ Grumont ea 1994 ].
Shirakawa et al, 1989 показали, что интерлейкин-1 , также как липополисахариды ( LPS ) и форбол 12-миристат 13-ацетат ( PMA ) ( Sen and Baltimore, 1986 ), может активировать NF-kB по механизму, независящему от белкового синтеза. Это подтверждается тем фактом, что индукция b-интерфероном не блокируется циклогексимидом в большинстве клеточных типов. И, в действительности, ген b-IFN , схожий с k- геном , может индуцироваться циклогексимидом.
Важным признаком последовательностей, связывающихся с NF- kB, является то, что одни из них асимметричны в нуклеотидной последовательности (сайт для k-энхансера : GGGACTTTCC), а другие являются палиндромами (сайт для Н-2К : GGGGATTCCCC) . Асимметричный сайт связывания для NF-kB характерен для индуцибельных регуляторных элементов, таких как IRF b-IFN и k-энхансер. Причем каждый из этих элементов в отдельности способен функционировать как индуцибельный энхансер , который отвечает на повышенное связывание NF-kB.
NF-kB является уникальным среди транскрипционных регуляторных белков. Он играет роль внутриклеточного медиатора большого количества внешних воздействий в некоторых типах клеток, участвует в регуляции синтеза цитокинов .
Как уже говорилось выше, NF-кВ состоит из двух ДНК-связывающих субъединиц р50 и р65 и ингибиторной субъединицы IkBальфа [ Beg A. et al., 1992 ]. В активной димерной форме состоит из субъединиц р50-р65 или р50-Rel [ Dobrzanski ea 1994 ]. NF-kB [ Fujita T. et al., 1989 ], участвует в активации транскрипции многочисленных цитокиновых и иммунорегуляторных генов [ Beg A. et al., 1993 ].Первичным сигналом, включающим многоступенчатый процесс активации NF-кВ, служит связывание внеклеточных лигандов (например, TNF и IL-1 ) с соответствующими трансмембранными рецепторами. В неактивной тримерной форме NF-кВ удерживается в цитоплазме субъединицей 1кВ , которая диссоциирует из комплекса после фосфорилирования специфическими протеинкиназами (например PKCдзета ) [ Cao ea 1996 ] или протеинкиназой PKR [ Kumar A. et al., 1994 ], которая активируется при вирусных инфекциях. После этого IкВ разрушается убиквитин-зависимыми протеазами , тогда как димер NF-кВ перемещается в ядро и связывается там с ДНК [ Dobrzanski ea 1994 ] например с доменом PRDII гена IFN-бета [ Garoufalis E. et al., 1994 ].
Гетеродимер NF-кВ преимущественно связывается с последовательностью ДНК, описываемой консенсусом 5' -GGGPuNNPyPyCC-3/ ( Grimm & Baeuerle, 1993 ). р50 и р65 содержат 300-аминокислотный участок высокой гомологии, необходимый для димеризации и связывания с ДНК. Этот район был также найден у клеточного онкогена c-Rel , его клеточного аналога v-Rel и морфогена дрозофилы Dorsal. В связи с этим он был обозначен как NRD (NF-KB/Rel/Dorsal) или Rel-домен ( Рис. 2 ). С-концевая область NRD участвует в димеризации ( Logeat et. al., 1991 ), тогда как N-концевая область является ДНК-связывающей ( Matthews et. al., 1992 ; Kunar et. al., 1992 ). В начале 1995 года две группы исследователей определили кристаллическую структуру гомодимера р50 в месте контакта с ДНК консенсусного сайта связывания ( Ghosh et. al., 1995 ; Muller et. al., 1995).
В отличие от ранее охарактеризованных ДНК-связывающих белков, р50 взаимодействует с ДНК не посредством коротких aльфа-спиралей, а через петли. В энергию связи вносят вклад фосфатные контакты как в N-, так и в C-концевой областях NRD, которые заякоревают димер и располагают над центром сайта связывания. Кроме того, одна из петель N-концевой части домена ("узнающая") проникает в большую бороздку ДНК и образовывает специфические связи с нуклеотидами (GGGG на 5'-конце консенсусного сайта). К С-концу NRD примыкает кластер положительно заряженных аминокислот, который представляет собой сигнал ядерной локализации (NLS) . Для р50 его последовательность имеет вид Arg-Lys-Arg-Gln-Lys , а для р65 Lys-Arg-Lys-Arg . Благодаря наличию этих сигналов р50 и р65 могут быть транслоцированы в ядро клетки ( Blank et. al., 1991 ; Henkel et. al., 1992 ), причем этот этап представляется важным для участия NF-kB/Rel в регуляции экспрессии различных генов. Последовательность р50 обрывается практически сразу же за NLS, в то время р65 имеет дополнительные 250 аминокислот в С-конце, содержащие транс-активирующие домены. Предполагается, что АТД р65 относится к классу кислотных активаторов ( Grimm & Baeuerle, 1993 ). С-конец субъединицы р65 содержит два домена ТА1 и ТА2 , состоящие из 30 и 100 аминокислот соответственно. Оба эти домена несут преимущественно отрицательно заряженные остатки аминокислот, причем ТА- содержит мотив, подобный ТА-, и образуют конформации типа a-спирали, присущие кислотным АТД.
Другое отличие р50 от р65 состоит в том, что р50 экспрессируется не в виде активного ДНК-связывающего белка, а в виде предшественника 105 кДа ( р105 ), не способного к взаимодействию с ДНК ( Kieran et. al., 1990 ). С-концевая часть предшественника р50 содержит восемь раз повторяющуюся последовательность из 30-33 аминокислот, найденную ранее в некоторых белках, контролирующих клеточный цикл, анкирине и белках-ингибиторах NF-кВ (называемых 1кВ) . Этот участок был обозначен как ANK (ankyrin repeats) . С-конец р105 обладает функциями, подобными IкВ, т. е. является цитоплазматическим ингибитором активного MF-кВ. Расщепление молекулы предшественника происходит в Gly- богатом участке, состоящем из 34 аминокислот и расположенном между NRD и С- концом р105. В цитоплазме большинства типов клеток NF-кВ постоянно присутствует в комплексе с белком-ингибитором IкВ, который непосредственно взаимодействует с NLS субъединицы р65 и тем самым препятствует транслокации NF-кВ в ядро клетки ( Baeuerle & Baltimore, 1988 ; Beg et. al., 1992 ; Ganchi et. al., 1992 ).
После активации клеток NF-kB высвобождается и транслоцируется в ядро. Считается, что конечной мишенью активирующих биохимических сигналов является IкВ, который подвергается модификации, предположительно фосфорилированию и последующему протеолизу, что способствует разрушению комплекса NF-kB/IkB . Возможно также, что этот комплекс деградирует быстрее, чем NF-кВ ( Baeuerle & Baltimore, 1988 ; Ghosh & Baltimore, 1991 ; Henkel et. al., 1993 ). В качестве активаторов транспорта NF-кВ в ядро и его последующей кВ-связывающей активности могут служить ЛПС , форболовые эфиры , цитокины , двуцепочечная РНК и др.
Следует также отметить, что существуют различные пути передачи внутриклеточных сигналов , приводящие к необходимой модификации ингибитора ( Shirakawa & Mizel, 1989 ; Schultze et.al., 1992 ; Machleidt et.al., 1994 ). Таким образом, комплекс NF-kB/IkB находится на пересечении нескольких важных каскадов биохимических событий, приводящих к активации клетки.
NF-kB и глюкокортикоидные рецепторы
Транскрипционные факторы NF-kB/Rel
NF-kB: взаимодействие с интегратором CBP
Факторы семейства Rel/NF-kB: подавление апоптоза
NO: активация протеинкиназы C и фактора NF-kB
NF-kB: активация АФК или промоторами канцерогенеза
Смотрите также:
