Гибридизация нуклеиновых кислот
Многие этапы анализа рекомбинантной ДНК основаны на комплементарности взаимодействия цепей нуклеиновых кислот - необходимом условии синтеза ДНК и РНК. Путем нагревания или обработки щелочью двухцепочечную ДНК разделяют на отдельные цепи (денатурированная ДНК). Денатурированную ДНК инкубируют в условиях, обеспечивающих гибридизацию нуклеиновых кислот, то есть повторное образование двухцепочечных молекул путем спаривания нуклеотидов комплементарных цепей. Эта реакция настолько специфична, что гибрид одноцепочечной молекулы ДНК с комплементарной цепью (РНК или ДНК) можно выявить, даже если кДНК составляет лишь одну десятитысячную часть от общего количества ДНК.
Метод позволяет различить полностью и частично гомологичные последовательности.
Специфичность гибридизации нуклеиновых кислот, часто в сочетании с фракционированием или амплификацией, позволяет выявить нужный ген среди десятков тысяч других или нуклеиновую кислоту возбудителя инфекции даже тогда, когда единственная ее копия приходится на несколько клеток человека.
Для выявления гибридизационных зондов используют радиоактивную метку или нерадиоактивные методы.
Часто применяется гибридизация нуклеиновых кислот с аллель-специфическими зондами. Такой зонд представляет собой синтетический одноцепочечный олигонуклеотид, обычно длиной 15-20 нуклеотидов. Синтезируют два зонда, различающиеся одним нуклеотидом. Один из них точно соответствует нормальной последовательности, а другой - мутантной; в последнем замещенный нуклеотид расположен в средней части зонда. Условия гибридизации подбирают таким образом, что олигонуклеотид связывается только с идеально комплементарной ему последовательностью. Аллель-специфические олигонуклеотидные зонды можно использовать в сочетании с блоттингом по Саузерну , но сейчас их чаще используют в сочетании с амплификацией ДНК.
Гибридизация - связывание комплементарных цепей нуклеиновых кислот.
Смотрите также:
