CpG Островки
ДНК позвоночных ковалентно модифицируется метилированием цитозина ( основания ) в динуклеотидной последовательности 5'CpG3'.
CpG - это сокращение для цитозина и гуанина , разделенных фосфатом, связывающим эти два нуклеотида вместе в ДНК.
Островки CpG - это участки высокой плотности CpG, лишенные метилирования CpG, обнаруживаемого на промоторах большинства генов человека. Долговременный сайленсинг гена может быть обеспечен метилированием района островков CpG. Например, таким путем сайленсированы гены на неактивной Х-хромосоме и некоторые импринтированные гены. Кроме того, некоторые гены в раковых клетках аберрантно сайленсированы метилированием островков CpG.
Островки CpG были выявлены как фракция ДНК позвоночных, которая необычно часто расщепляется рестрикционными ферментами, чувствительными к метилированию ДНК ( Cooper et al., 1983 ). Клонирование этих так называемых "крохотных НраII-фрагементов" показало, что они происходят из последовательностей, обогащенных CpG и имеющих длину около 1 т.п.н., которые не метилированы в зародышевых клетках, у ранних эмбрионов и обычно также во всех соматических тканях ( Bird et al., 1985 ). Островки CpG ( рис. 18.4 ) являются поэтому исключением из "глобального" метилирования CpG, преобладающего в большей части генома млекопитающих. Ранние работы по картированию промоторов индивидуальных генов выявили районы, обогащенные GC, вблизи промоторов генов ( McKeon et al., 1982 ), и сейчас очевидно, что большинство (если не все) островки CpG маркируют промоторы и 5'-домены генов. Приблизительно 60% генов человека имеют промоторы с островками CpG.
Для генома эукариот характерно наличие изохор (isochores). В GC богатых изохорах (isochores) локализовано большое количество СрG-островков, характеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина (более 60%), представленных в виде кластеров неметилированных СрG-дуплетов и так называемых G/С-боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Spl - (G)4С(G)4С [ Bird A.P., 1986 ; Lindsay S., Bird A.P., 1987 ; Aissani В., Bernardi G., 1991 ]. СрG-островки содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы HpaII , а также сайты для редкощепящих рестриктаз , узнающих неметилированные СрG-дуплеты. В частности, более 80% Nor 1-сайтов связано с СрG-богатыми островками.
Характерным свойством CpG-островков является их локализация вблизи структурных генов, преимущественно в их 5'-участках (регуляторные последовательности, промоторы, последовательности первого экзона) [ Baylin, ea 1998 , Gardiner-Garden, ea 1987 , Turker, ea 1999 ]. Анализ полностью расшифрованных к настоящему моменту нуклеотидных последовательностей хромосом 21 и 22 человека [ Hattori, ea 2000 , Dunham, ea 1999 ] подтверждает это общее положение. Формальные признаки CpG-островков (присутствуют в промоторных зонах примерно 60% генов человека):
- размеры от 0,5 до 5 тыс. пар оснований (т.п.о.) (в среднем 1 т.п.о.);
- встречаемость примерно 1 на 100 т.п.о.;
- обычное (т.е. соответствующее расчетному 1:16) содержание динуклеотида CpG;
- С + G превышает 60%; отношение CpG/GpC не менее 0,6 [ Antequera, ea 1995 ].
За несколькими известными исключениями (см. выше) CpG-островки неметилированы во всех типах тканей независимо от экспрессии соответствующего гена. С этой точки зрения важен вопрос о пространственной соотнесенности структурных генов и CpG-островков. Примерные расчеты свидетельствуют о том, что свыше половины генов, составляющих функционирующий геном человека, содержат CpG-островки: они имеются, по-видимому, у всех генов, выполняющих базовые клеточные функции ( генов домашнего хозяйства ), и у примерно 40% генов, выполняющих специализированные функции ( рис. 3 ). Значительная часть тканеспецифических генов не имеет в своих промоторах CpG-островков: вместо них могут присутствовать одиночные CpG-динуклеотиды.
Наибольшая плотность СрG-островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1 , 9 , 15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 [ Antonarakis S.E., 1994 ]. Точные молекулярные методы регистрации СрG-островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45000 [ Antequera F., Bird A.P., 1993 ].
В геноме млекопитающих CpG встречаются гораздо реже, чем можно было ожидать, исходя из вероятности их встречаемости, рассчитанной на основании G+C соседства в ДНК. При этом существуют протяженные последователльности с повышенным содержанием этого динуклеотида - CpG островки, участки ДНК длиной более 200 по с содержанием G+C более 50% и с содержанием CpG динуклеотидов более 60%. Они локализуются преимущественно в R-сегментах и поддерживаются в неметилированном состоянии в клетках зародышевой линии и нормальных соматических тканей. Исключение составляют островки в генах, подвергнутых импринтингу, в генах инактивированных X-хромосом, а также в повторяющихся элементах генома LINE и SINE (например, Alu), где они сильно метилированы. Длина промоторов, в которых встречаются островки, как уже говорилось выше, около 1 кб. Иногда эти островки могут находиться и в кодирующих частях генов. Вообще их позиция относительно старта транскрипции может сильно меняться от гена к гену.
Полагают, что именно неметилированное состояние CpG- островков стабилизирует их структуру в эволюции генома из-за более низкой скорости мутирования по сравнению с 5-mC, который в результате дезаминирования часто превращается в тимин со всеми вытекающими отсюда мутагенными последствиями. В гаплоидном геноме человека обнаруживают около 45000 CpG-островков, и считается, что большинство из них ассоциировано с генами. Промоторы многих генов домашнего хозяйства содержат неметилированные CpG-островки.
В настоящее время непонятен механизм поддержания CpG- островков в неметилированном состоянии. Поскольку Мтаза обладает способностью метилировать их in vitro, структурные особенности ДНК сами по себе не способны это обеспечивать. Считается, что в поддержании неметилированного состояния островков участвуют специфические белки хроматина. Хроматин CpG-островков не содержит гистона H1, а гистоны H2A и H2B в этих участках хроматина недоацетилированы. Кроме того, CpG-островки часто содержат сайты связывания фактора транскрипции Sp1, который, взаимодействуя как с метилированными, так и неметилированными сайтами, предотвращает их исходное или дальнейшее метилирование. Полагают, что именно этот фактор может играть ключевую роль в постоянном поддержании генов домашнего хозяйства в неметилированном активном состоянии.
Для соматических клеток, растущих в первичной культуре, характерно быстрое изменение характера метилирования ДНК. Это изменение часто связывают с ограниченным пролиферативным потенциалом культивируемых клеток и их старением как in vivo, так и in vitro. Многие гены культивируемых клеток гиперметилированы, а отдельные CpG-островки аутосом, поддерживаемые in vivo в неметилированном состоянии, переходят в метилированное состояние.
Полагают, что гиперметилирование ДНК и инактивация многих генов культивируемых клеток являются следствием отбора, направленного на выключение экспрессии генов, которые не требуются безусловно для выживания клеток в культуре. Кроме того, в культуре происходит отбор клеток на способность к быстрому делению, поскольку быстро делящиеся клетки вытесняют медленно пролиферирующие. Поэтому гены, вызывающие задержку клеточного цикла и терминальную дифференцировку клеток, например, p16 или MyoD1 , быстро инактивируются у культивируемых клеток под действием мутаций или гиперметилированием.
У млекопитающих паттерны метилирования устанавливаются в ходе эмбрионального развития и поддерживаются механизмом копирования при делении клеток. Наследуемость паттернов метилирования ДНК делает эпигенетическую маркировку стабильной в ряду многих клеточных делений и, следовательно, составляет одну из форм клеточной памяти .
CG - островки как маркеры генов
CpG островки и метилирование ДНК в регуляции транскрипции
Смотрите также:
