FISH (Метод флюоресцентной гибридизации in situ)
Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH - fluorescence in situ hybridization) включает применение уникальных нуклеотилных последовательностей ДНК в качестве зонда для поиска нужных последовательностей ДНК в материале, полученном от пациента. Локус-специфический или ген-специфический ДНК-зонд помечен определенным маркером (например, флюорохромом), что обеспечивает его обнаружение при флюоресцентной микроскопии. Исследуемая ДНК представляет собой препарат хромосом для микроскопического исследования, содержащий нити в метафазного ядра в интерфазе (в неделящемся состоянии). ДНК-зонд и исследуемую ДНК денатурируют , что приводит к образованию одноцепочных ДНК. ДНК-зонд добавляют к препарату хромосом и инкубируют в течение времени, достаточного для гибридизации ДНК-зонда и комплементарных последовательностей ДНК больного, если у больного имеется участок ДНК, комплементарный ДНК зонду. Гибридизация происходит только на комплементарных участках ДНК и не касается фрагментов с иными последовательностями ДНК из других частей генома. Присутствие или отсутствие меченного флюорохромом зонда в составе ДНК после гибридизации определяется при исследовании хромосом с помощью флюоресцентной микроскопии. Результат, как правило, не вызывает сомнения ( рис. 28.1 ).
Преимущества FISH включают быстрый анализ большого числа клеток, высокую чувствительность и специфичность, возможность исследовать некультивируемые и неделящиеся клетки. С помощью этого метода можно исследовать клетки, содержащиеся в парафиновых срезах. Недостатки метода заключаются в невозможности получить информацию о физическом состоянии исследуемой ДНК или участка хромосомы. Проведение FISH требует знания локуса, вовлеченного в хромосомную аберрацию, а также подбора соответствующего ДНК-зонда, который сможет выявить данную аберрацию. FISH не используется в качестве скринингового метода. Метод применяется для того, чтобы получить ответ на конкретный вопрос (определить отсутствие или наличие предполагаемой специфической мутации). Как правило, он дополняет классические методы окрашивания хромосом, а также является основным способом идентификации хромосом в метафазе или интерфазе и специфических нуклеотидных последовательностей ДНК, лежащих в основе определенного заболевания (фенотип).
FISH применяют в пренатальной диагностике и для характеристики опухолей; в педиатрической практике его используют, как правило, для идентификации субмикроскопических делеций , ассоциированных со специфическими пороками развития . Синдромы, в основе которых лежат микроделеции , раньше считались заболеваниями неизвестной этиологии, так как хромосомные делеции и перестройки, вызывающие развитие этих заболеваний, обычно не визуализируются при традиционных методах хромосомного анализа. Такие мелкие делеции в специфических участках хромосом можно с большой точностью выявить методом FISH. К заболеваниям, обусловленным субмикроскопическими делециями, относятся синдром Прадера-Вилли , синдром Ангельмана , синдром Вильямса , синдром Миллера-Дикера , синдром Смит-Мадженис и велокардиофациальный синдром ( рис. 28.2 ). FISH облегчает диагностику этих синдромов в нетипичных случаях, особенно в младенческом возрасте, когда еще отсутствуют многие диагностически значимые признаки заболевания. Применение этого метода целесообразно также в подростковом и во взрослом возрасте, когда типичные клинические признаки заболевания, характерные для детского возраста, претерпевают изменения.
Смотрите также:
