Гены человека мутантные: клонирование и идентификация
Клонирование генов может быть основано на:
- знании структуры соответствующего белка;
- возможности отбора клеток на основании функции гена;
- знании точного положения гена в геноме (позиционное клонирование) или
- совокупности сведений о фенотипе, о приблизительном положении в геноме изучаемого гена и соседних с ним генов (позиционный подход к поиску генов-кандидатов).
Первые успешные эксперименты по клонированию генов проводили следующим образом: сначала выделяли и очищали интересующий белок, определяли аминокислотную последовательность его фрагментов, получали антитела, которые применяли для разработки ИФА , затем на основе известных аминокислотных последовательностей синтезировали олигонуклеотиды, которые использовали как зонды и в качестве праймеров для ПЦР , на последнем этапе выделяли мРНК, получали библиотеку кДНК , продукты экспрессии которой исследовали с помощью ИФА.
Получены базы данных, позволяющие установить последовательность экспрессируемого гена по короткому фрагменту аминокислотной последовательности продукта.
Иногда ген клонируют только на основании его функции, даже если не известны ни кодируемый им белок, ни положение гена на генетической карте. Например, различные гены, мутации которых вызывают нарушение репарации ДНК, были выделены путем отбора клонов, восстанавливающих нормальный фенотип в клетках с нарушением репарации.
Позиционное клонирование - это выделение гена только на основании его положения в геноме, без знания функции. Этот подход основан на анализе образцов ДНК из семей больных с целью поиска генетического маркера, расположенного рядом с вызывающим заболевание мутантным геном, как это показано на рис. 65.13 , Б. Приблизительно локализовав мутантный ген, получают перекрывающиеся клоны, содержащие этот участок ДНК, после чего идентифицируют гены и устанавливают, какой из них вызывает заболевание, часто путем выявления небольших мутаций в одном из них ( рис. 65.14 ). Задача облегчается, если известны хромосомные транслокации, которые можно использовать для картирования и идентификации мутантного гена. С помощью этого подхода выявлены мутантный ген, вызывающий миопатию Дюшенна , мутантный ген, вызывающий муковисцидоз , мутантный ген, вызывающий ретинобластому , мутантный ген, вызывающий аденоматозный полипоз толстой кишки , мутантный ген, вызывающий нейрофиброматоз , мутантный ген, вызывающий болезнь Гентингтона , мутантный ген, вызывающий семейный рак молочной железы типа 1 и мутантный ген, вызывающий семейный рак молочной железы типа 2 .
С ростом числа изученных генов растет эффективность позиционного поиска генов-кандидатов, возможно, вызывающих заболевание. Иногда ген-кандидат выявляют непосредственно по известным белкам, участвующим в патогенезе, но чаще его поиск требует приблизительного генетического картирования, хотя и менее точного, чем при позиционном клонировании.
Располагая ограниченными сведениями о положении мутантного и соседних с ним генов в геноме и учитывая данные, полученные, например, на мышах, можно предположить, что болезнь вызывает именно этот мутантный ген. Для проверки гипотезы проводят амплификацию и клонирование гена, выделенного у больных. Благодаря этому подходу выявлены мутации гена тяжелой бета-цепи сердечного миозина при семейной гипертрофической кардиомиопатии ; мутации гена фибриллина при синдроме Марфана ; мутации протоонкогена RЕТ при МЭН типа II и мутации различных генов, вызывающих нарушение репарации ДНК при синдроме Линча .
Исследования на мышах показали, что синдром Ваарденбурга обусловлен мутацией гена PAX3 .
Один из вариантов поиска генов-кандидатов состоит в выведении мышей с заданной мутацией и идентификации генов-кандидатов на основании сходства признаков, выявленных у мыши, с признаками заболевания у человека.
Локализация многих мутантных генов, вызывающих заболевания, показана на рис. 65.15 ; большинство этих генов клонировано.
